今天推送的文章发表在BioresourceTechnology上的“SimultaneousenhancementofactivityandstabilityofBacillussafensis-derivedlaccaseanditsapplicationinlignocellulosesaccharification”。

农业工业废弃物，包括麦麸、米糠、玉米秸秆、甘蔗渣、黑豆和绿豆废弃物以及花生壳废弃物，都含有丰富的木质纤维素，将这些木质纤维素转化为可以有效消费的商品至关重要。酶法是一种低成本但有效的脱木素解决方案，漆酶因其出色的催化活性和进行非特异性氧化的巨大潜力而受到青睐。限制漆酶工业利用的一个瓶颈是在极端操作条件下保持其活性和稳定性。通过蛋白质工程优化漆酶将产生具有所需特性的定制生物催化剂。然而，在酶修饰过程中，增强的热稳定性往往伴随着酶活性的降低，反之亦然。为了突破这一限制，蛋白质工程领域已经开发出许多策略。本研究从中鉴定出一种新型漆酶（rLAC），以rLAC为模型蛋白，采用基于祖先序列的半理性设计策略，结合计算机辅助设计，通过一系列组合突变实现活性和稳定性的同时增强。这些组合突变体不仅表现出显著的热稳定性增强，而且相对于野生型蛋白（WT）表现出较高的活性。最后，研究了构建的突变体与商业酶结合对玉米秸秆和甘蔗渣的降解。

rLAC的克隆与表达

如图1所示，平面图显示了蛋白质序列，上方显示了二级结构元素（螺旋用波浪线表示，β链用箭头表示，转角用TT字母表示），序列下方的横条表示亲水性（红色表示疏水性，白色表示中性，蓝色表示亲水性）。漆酶的活性位点通常含有四个铜离子，分为I型铜（T1）、II型铜（T2）和两种III型铜（T3）。T1铜离子为单核中心，是漆酶催化底物氧化过程中形成的初始电子受体，从底物获得电子后，将其转移给T2和T3铜离子，形成三核铜中心。通常可以在T1和T2/3活性位点附近发现一些α螺旋。rLAC的三个铜离子结合域各含有一个α螺旋（图1）。rLAC的开放阅读框(ORF)编码一个510个氨基酸的蛋白质。与已报道的其他芽孢杆菌属漆酶相比，rLAC的比对氨基酸序列与来自()的漆酶同源性最高(95.49%)，其次是来自(67.57%,)、(66.02%,)、(65.18%,)、（64.98%，MK396097）和（61.36%，）中分别获得rlac。以TCCC111022基因组为模板，经PCR扩增得到1.5kb的rlac。纯化的rLAC在SDS-PAGE凝胶上显示约56kDa的清晰条带。经测定，rLAC的比活为6.6U/mg。

rLAC的酶学特性

在的缓冲溶液中，以ABTS为底物，研究了温度对rLAC活性的影响（50~100℃）。如图2A所示，rLAC活性在50~80℃范围内随温度升高而升高，在80~100℃范围内随温度升高而降低。在80℃时，rLAC活性达到最大。此外，在不同温度（50~90℃）下检测了rLAC的热稳定性。在低于50℃的温度下预孵育2小时后，rLAC的活性损失最小，在80℃孵育2小时后，其活性仍保留了20%以上的初始活性（图2B）。随后，研究了rLAC在4℃下范围内的酶活性。结果表明，缓冲液的pH对rLAC的酶活性有很大影响。如图2C所示，当使用ABTS作为底物时，rLAC在时表现出最大相对活性，在和6.0时分别保留了其最大活性的约53％和60％。此外，通过评估rLAC在4℃下孵育0-10天后的残留活性，研究了rLAC在不同pH缓冲液（、5.0、7.0和9.0）中的稳定性。10天后，在、5.0、7.0、9.0下，其活性分别保留了31%、52%、55%、50%（图2D），表明rLAC适用于多种pH环境。在不同金属离子浓度的缓冲液中测定了rLAC活性。如图2E所示，随着金属离子浓度的增加，酶活性逐渐降低。Mn2+和Fe2+显著抑制了rLAC活性。此外，rLAC在不同浓度的Ni2+缓冲溶液中保持稳定，保留了70%以上的活性，在Ca2+、Mg2+和Zn2+缓冲溶液中保留了60%以上的活性。

结构引导预测rLAC突变位点

本研究通过同源性建模获得了rLAC的三级结构（图3A）。结构分析显示rLAC具有三个铁氧还蛋白样结构域，其中四个铜原子以铜中心的形式存在，分别为T1（His419、His497、Cys492和Met502）、T2（His103和His422）和T3（His105、His151、His153、His424、His491和His493）。为了了解温度对rLAC结构的影响，分别在80°C和100°C下进行了MD模拟。如图3B所示，与100°C系统相比，rLAC在80°C系统中表现出较小的RMSD值。这表明蛋白质构象在100°C时不太稳定，可能表明蛋白质不耐高温。

为了增强rLAC的热稳定性和催化活性，结合MD模拟、HotspotWizard和DEZYME的结果设计了氨基酸突变。如图3C所示，rLAC的氨基酸Phe81、Asp221和Tyr441在100°C下的RMSF值高于80°C下的RMSF值，并且这些残基附近的区域在高温下更具柔性。随后，通过HotspotWizard预测了3个突变残基（Glu231、Arg352和Phe355），这些残基的突变可能会影响酶活性，其中Glu231位于预先选定的柔性区域内（图3D）。随后，使用“laccase”作为关键词搜索NCBI数据库以获取氨基酸序列，然后进行聚类分析以去除重复或冗余序列，应用40％序列相似性的冗余阈值，得到69个独特序列。总共通过对这69个序列进行祖先序列重建获得了67个祖先序列。从祖先序列的频率分析中选择候选位点。Phe81，Asp221，Glu231和Tyr441分别被替换为两种最常见的氨基酸（图3E）。因此，将尝试将Phe81替换为Arg或Ile，将Asp221替换为Val或Tyr，将Glu231替换为Asn或Asp，将Tyr441替换为His或Phe。整合数据后，共筛选出F81P、F81R、F81I、D221P、D221V、D221Y、E231P、E231D、E231D、Y441P、Y441H、Y441F等12个单突变体。

有益的rLAC突变体的构建及鉴定

根据计算分析结果合理设计了12个单突变体。如图4A所示，WT的残留比活力为6.6U/mg，突变体F81R和Y441P没有酶活力，四个突变体D221Y、E231D、Y441H和Y441F的残留活力高于WT。这四个突变体在80°C孵育30分钟后也表现出比WT更高的残留活力。此外，在100°C下，与WT相比，D221Y的半衰期增加了192%，Y441H增加了150%，E231D和Y441F增加了70-80%（图4B）。接下来，通过D221Y、E231D、Y441H、Y441F的组合，通过迭代进化进一步提高WT的活性和热稳定性，构建并表达了突变体E231D/Y441H、D221Y/Y441H、D221Y/Y441F、E231D/Y441F、D221Y/E231D。这5个双点突变体的比活性也较单点突变体有所提高（图4C），其中E231D/Y441H的比活性最高。此外，对这5个双点突变体的半衰期分析显示，在50-100℃下，它们的半衰期均大于WT（图4D）。尤其在100℃下，E231D/Y441H的半衰期比WT提高了252%，其他几个双点突变体的半衰期比WT提高了80-120%。其中，双点突变体E231D/Y441H在相同温度下具有更优异的性能，其半衰期也显著高于单点突变体E231D和Y441H。因此，选择活性和热稳定性显著增强的E231D/Y441H进行进一步的多点突变尝试。以表现优异的突变体E231D/Y441H和D221Y为模板，进行迭代定点突变，构建组合三点突变体E231D/Y441H/D221Y，在60~100℃下，E231D/Y441H/D221Y的半衰期分别比WT提高了56%、67%、105%、157%和175%，低于E231D/Y441H和D221Y（图4E）。然后，检测到E231D/Y441H/D221Y的比活为7.31U/mg（图4C），相对比活比WT高约9%，但低于E231D/Y441H和E231D、Y441F、Y441H和D221Y。相对比活和半衰期分析的结果表明，三点突变体E231D/Y441H/D221Y不能有效提高WT的性能（图4C）。

E231D/Y441H活性与稳定性同时增强机理分析

为了研究突变体酶特性变化的机制，对WT和E231D/Y441H都进行了MD分析。E231D/Y441H的RMSD值在0-100ns时低于WT，表明E231D/Y441H的热稳定性更高。E231D/Y441H的Rg值明显低于WT，这表明E231D/Y441H的结构更紧凑。E231D/Y441H的SASA值低于WT。这些发现共同表明，E231D/Y441H比WT具有更高的比活性和稳定性（半衰期更长）。随后，计算了WT-ABTS和E231D/Y441H-ABTS的RMSF值（图5A）。观察到E231D/Y441H-ABTS中loop1（Asp216-Asp231，含有突变残基Asp231）和helix1（Glu439-Ser443，含有突变残基His441）的RMSF值明显高于WT-ABTS。还分析了WT-ABTS和E231D/Y441H-ABTS的B因子（图5B和图5C）。E231D/Y441H中loop1和helix1的B因子明显高于WT，这表明E231D/Y441H中的loop1和helix1具有更灵活的结构（图5D和图5E）。分析了WT-ABTS和E231D/Y441H-ABTS复合物的底物结合口袋入口内的结构变化。如图5D和图5E所示，loop1和loop2(Pro414-Thr418)位于底物结合口袋的入口处。在替换位于螺旋1上的残基441后，螺旋1移离了loop2（图5F）。观察到E231D/Y441H-ABTS的底物口袋入口残基Phe227（位于loop1中）和Arg416（位于loop2中）与WT-ABTS相比位置更远（图5G）。这些结构分析揭示了E231D/Y441H-ABTS底物口袋周围的这三个环（loop1、loop2和螺旋1）呈扩大趋势。

CellicCTec2与HBT结合的漆酶对木质纤维素进行糖化

在由碱提取的玉米秸秆和甘蔗渣制备的样品C0-C6和S0-S6中研究了脱木质素对可溶性糖产生的影响（图6A-B）。经CellicCTec2处理的样品（C1和S1）显示出与用CellicCTec2和HBT处理的生物质样品（C2和S2）几乎相同的还原糖释放和木质素释放。如图6A所示，与C1相比，C3（CellicCTec2和WT处理的玉米秸秆）还原糖释放量增加了1.25倍，C5（CellicCTec2和E231D/Y441H处理的玉米秸秆）还原糖释放量增加了2.55倍。添加介质（HBT）后，C4（WT、CellicCTec2和HBT处理的玉米秸秆）还原糖释放量增加了2.35倍，C6（E231D/Y441H、CellicCTec2和HBT处理的玉米秸秆）还原糖释放量增加了3.25倍。此外，添加漆酶的样品（C3~C6）木质素释放量极显著增加，添加HBT的样品（C4和C6）木质素释放量高于未添加样品（C3和C5）。如图6B所示，经E231D/Y441H、CellicCTec2和HBT处理的甘蔗渣中还原糖释放量最大，比S1增加了3.35倍。此外，与S1相比，S3（经CellicCTec2和WT处理的甘蔗渣）的还原糖释放量增加了1.20倍，S4（经CellicCTec2和E231D/Y441H处理的甘蔗渣）的还原糖释放量增加了2.25倍（图6B）。此外，与WT（S5和S6）相比，E231D/Y441H（S3和S4）对木质素的分解更强。随后，用FTIR在400-4000cm−1范围内检测了不同处理条件下样品官能团的变化。观察到样品的红外光谱强度变化明显，特别是在3430-2920cm−1和1650-1000cm−1之间的波段（图6C和图6D）。在用HBT处理的样品中观察到3423cm−1峰值处的吸收率降低，这归因于木质素的OH拉伸。与其他样品相比，用E231D/Y441H处理的样品（C5、C6、S5和S6）的吸光度降低。2925cm-1处的吸收带与脂肪族基团的C-H伸缩振动有关。此外，可以在1458cm-1和1631cm-1处的谱带位置观察到化学变化。与C=C振动相关的1596cm-1处的峰与原始样品（C0和S0）相比，酶处理后（C1-C6和S1-S6）有所减少，表明木质素分子内的键断裂。在1370和1375cm−1之间的谱带位置检测到的化学变化与纤维素的C-H拉伸有，而1247和1242cm−1之间的谱带则归因于酚类化合物（包括木质素）的C-O拉伸和C-O-H变形。与原始样品S0和C0相比，在样品C1-C6和S1-S6中观察到的化学键合变化表明，玉米秸秆和甘蔗渣的内部结构因添加酶和介质而发生了改变。

SEM照片观察了样品的纤维形态（图6E）。原始样品（C0和S0）表面形态致密、光滑、未受干扰，纤维素纤维成束排列。经CellicCTec2处理后，C1和S1呈现破坏性形态，样品C1的单链纤维明显水解。在CellicCTec2（C2和S2）基础上添加HBT，木质纤维素的内部结构基本保持不变。经CellicCTec2和漆酶处理的样品C3和S3木质纤维素基质破坏，出现碎裂。双酶水解的联合作用去除了纤维束的天然粘合材料木质素和半纤维素。与C3和S3相比，含有HBT的C4和S4孔隙更细。与用WT处理的样品相比，用E231D/Y441H处理的样品显示出更细的孔隙。用CellicCTec2、漆酶和HBT处理时，玉米秸秆和甘蔗渣都表现出类似的表面形态变化。

DOI：10.1016/